回顧
????????在建庫(kù)之前，我們需要對(duì)先前提取的核酸進(jìn)行質(zhì)檢。只有質(zhì)檢合格的樣本才能繼續(xù)建庫(kù)、測(cè)序、分析。（質(zhì)檢的內(nèi)容在上一章節(jié)也有描述）這里再回顧下質(zhì)檢的內(nèi)容主要分以下幾部分：
1. ?凝膠電泳實(shí)驗(yàn): DNA是否降解 ，是否有其他的污染(跑膠， 與marker條帶比較)
2. 紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值: 檢測(cè)提取DNA純度情況（OD260/OD280比值約接近1.8，說(shuō)明提取DNA純度越高）
3. Qubit濃度定量。
DNA文庫(kù)構(gòu)建
常規(guī)基本的步驟有：1 DNA的片段化、2: 末端補(bǔ)平，3 端加A 、4 ?連接測(cè)序接頭、5 PCR擴(kuò)增和純化。
01 DNA的片段化
????????建庫(kù)的第一步就是獲得片段大小合適的DNA分子，那么就需要對(duì)DNA 進(jìn)行打斷.
問(wèn)題：那么問(wèn)題來(lái)了，DNA打斷多少bp合適？
????????1.取決于測(cè)序儀，比如準(zhǔn)備上PE150, 那么打斷的片段可以在300bp左右，比如上SE50,只要打斷50~100bp即可；（這里沒(méi)有理解的話，要和測(cè)序原理聯(lián)系起來(lái)）
????????2.取決測(cè)序的目的，如果我們測(cè)序的reads是用于組裝，這樣我們可以將打斷到250左右，有更多的overlap區(qū)域，便于我們數(shù)據(jù)組裝，可變剪切。
片段化的方法主要分酶法打斷和超聲波打斷。
????????酶法打斷:?用限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別并切割磷酸與脫氧核糖之間的化學(xué)鍵，需要控制酶切時(shí)間和酶量。優(yōu)勢(shì)：高通量可一次性做多個(gè)樣本，易操作；劣勢(shì)：偏好性嚴(yán)重，對(duì)樣本的質(zhì)量要求嚴(yán)苛。
????????超聲波打斷:自適應(yīng)聚焦聲波在樣本中造成氣穴現(xiàn)象從而機(jī)械隨機(jī)的切斷DNA，長(zhǎng)片段的DNA，受到的剪切力比較大。優(yōu)勢(shì)：片段隨機(jī)打斷，無(wú)偏好性。劣勢(shì)：成本高，機(jī)械損傷大。
問(wèn)題：什么情況如何選擇酶法打斷和超聲波打斷？
????????1.根據(jù)樣本的情況：比如起始量低（低于50ng以下） ?這種情況 不宜用機(jī)械打斷，機(jī)械打斷對(duì)樣本損傷比較大，損失更多樣本導(dǎo)致建庫(kù)失敗。更適合用酶切的方法；
????????2.實(shí)驗(yàn)的目的和需求：比如甲基化測(cè)序、Chip-Seq 測(cè)序更適合用機(jī)械打斷。
打斷存在的問(wèn)題：片段化不足與過(guò)度
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到了這里，關(guān)于實(shí)驗(yàn)技術(shù)—測(cè)序數(shù)據(jù)不好，可能是建庫(kù)出了問(wèn)題？(上）的文章就介紹完了。如果您還想了解更多內(nèi)容，請(qǐng)?jiān)谟疑辖撬阉鱐OY模板網(wǎng)以前的文章或繼續(xù)瀏覽下面的相關(guān)文章，希望大家以后多多支持TOY模板網(wǎng)！
